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流式小課堂(一)丨流式對(duì)照知多少

更新時(shí)間:2025-12-16  |  點(diǎn)擊率:39

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流式細(xì)胞術(shù)定義

流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)是一種在功能水平上對(duì)液流中排成單列的動(dòng)物、植物等細(xì)胞或其它生物微粒(如微球、細(xì)菌、病毒等)逐個(gè)進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的檢測(cè)手段。該技術(shù)可以高速分析上萬個(gè)細(xì)胞,并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù),具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好、方法靈活等優(yōu)點(diǎn)。流式細(xì)胞術(shù)不僅能夠測(cè)量細(xì)胞的大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還能檢測(cè)細(xì)胞表面和胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA及RNA的含量。此外,流式細(xì)胞術(shù)能夠從單細(xì)胞水平同時(shí)分析細(xì)胞樣本中的基因表達(dá)和蛋白表達(dá),還可以檢測(cè)細(xì)胞活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞氧化等細(xì)胞功能。該技術(shù)不僅能獲得在單個(gè)細(xì)胞水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的海量數(shù)據(jù),還可以更加深入地了解異質(zhì)性細(xì)胞群的詳細(xì)信息。隨著流式細(xì)胞術(shù)水平的不斷提升,其應(yīng)用范圍也日益廣泛,目前已普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、干細(xì)胞學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。

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原理

流式細(xì)胞儀的液流系統(tǒng)由流動(dòng)室、樣品管、鞘液管和噴嘴組成。樣品在進(jìn)入流動(dòng)室之前,其中的細(xì)胞或微粒都是以隨機(jī)的方式進(jìn)行移動(dòng)。在進(jìn)入流動(dòng)室之后,樣品在液流壓力的作用下從樣品管中噴出,同時(shí)鞘液在高壓下由鞘液管噴出,包裹在樣品流四周,形成穩(wěn)定的同軸流動(dòng)狀態(tài),并使其聚焦為窄流,從而將細(xì)胞分離成單細(xì)胞列,然后從噴嘴高速噴出,形成細(xì)胞液柱。樣品流中的細(xì)胞或微粒在鞘液的作用下,會(huì)以相同的速度逐一通過激光檢測(cè)點(diǎn)。

光學(xué)系統(tǒng)由激發(fā)光源、分光鏡、濾光片以及產(chǎn)生光電流的檢測(cè)系統(tǒng)組成。樣品通過激光時(shí),儀器會(huì)記錄各單個(gè)細(xì)胞的前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)。FSC主要用于檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)大小,細(xì)胞越大,產(chǎn)生的FSC就越強(qiáng)。SSC則用于評(píng)估細(xì)胞的內(nèi)部復(fù)雜性,細(xì)胞內(nèi)顆粒成分和精細(xì)結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,產(chǎn)生的SSC就更強(qiáng)。經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受到合適的光激發(fā)后會(huì)產(chǎn)生許多不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào),分光鏡和濾光片可以將入射的激光束按照特定的角度和波長(zhǎng)進(jìn)行分散和反射,使不同波長(zhǎng)的光聚焦于不同的位置上。之后光信號(hào)通過光電倍增管(Photomultiplier tube, PMT)轉(zhuǎn)化為電信號(hào),傳輸?shù)綌?shù)據(jù)處理系統(tǒng)。


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對(duì)照設(shè)置

首先,我們需要了解非特異性信號(hào)產(chǎn)生的原因:比如常見的腫瘤細(xì)胞自發(fā)熒光,會(huì)造成背景信號(hào)干擾;又如在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞上,Fc受體均呈現(xiàn)高表達(dá),在染色過程中抗體Fc端與細(xì)胞表面Fc受體的結(jié)合以及抗體與細(xì)胞的物理結(jié)合與粘附等,也會(huì)造成非特異性染色的發(fā)生;樣本中的死細(xì)胞不僅具有更強(qiáng)的自發(fā)熒光,而且更容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合,造成假陽性;除此以外,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒感染、藥物處理、體外共培養(yǎng)等也可能會(huì)引入熒光信號(hào),對(duì)流式檢測(cè)結(jié)果造成一定干擾。

為了避免上述情況,在流式染色前需要使用Fc受體阻斷劑對(duì)Fc受體造成的非特異性染色加以去除。除此之外,還需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況設(shè)置以下幾種對(duì)照來排除非特異性信號(hào)。

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單染對(duì)照

由于熒光染料發(fā)射光不是一個(gè)單一的波長(zhǎng),而是覆蓋一定范圍,所以會(huì)有熒光滲漏到鄰近波長(zhǎng)的檢測(cè)器,在進(jìn)行多色流式實(shí)驗(yàn)時(shí),檢測(cè)的顏色越多,越容易發(fā)生熒光滲漏。校正溢漏的過程被稱為補(bǔ)償,補(bǔ)償可確保檢測(cè)器只計(jì)算該通道特定的熒光發(fā)射光。單染對(duì)照是只添加一種熒光抗體的樣本,可以顯示出不同熒光基團(tuán)之間光譜重疊的水平,并據(jù)此去除或補(bǔ)償它們之間的重疊。熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)設(shè)定好后,陽性細(xì)胞群應(yīng)位于“目標(biāo)通道陽性、其他通道陰性"的右下象限,陰性細(xì)胞群位于左下象限,兩群體應(yīng)垂直或平行于橫縱坐標(biāo)軸,左上象限不應(yīng)有明顯信號(hào)。同時(shí),單染對(duì)照還可以輔助調(diào)節(jié)通道電壓,把陽性峰調(diào)節(jié)到合適的位置,防止信號(hào)超出接收范圍。

單染對(duì)照注意事項(xiàng)  

1.單染對(duì)照細(xì)胞樣本,因?yàn)殡妷汉捅尘案咏鼘?shí)際樣本,無合適細(xì)胞樣本時(shí),可用微球代替。

2.同一通道內(nèi)的熒光染料具有不同的發(fā)射光譜,因此單染樣本的熒光染料必須與實(shí)驗(yàn)樣本中的保持一致,例如GFP和FITC這兩種熒光染料是不能相互替換的,因?yàn)閮烧叩陌l(fā)射光譜不一致。

3.實(shí)驗(yàn)中有幾種不同的熒光染料,就需要設(shè)置幾個(gè)單染對(duì)照組,一個(gè)也不能少。

4.由于復(fù)合染料的差異,單染對(duì)照的復(fù)合染料標(biāo)記抗體應(yīng)當(dāng)與實(shí)驗(yàn)所用的抗體相同(來自同一支抗體)。使用相同的復(fù)合熒光染料偶聯(lián)不同的抗體,甚至僅是不同批次抗體,都可能會(huì)導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果不準(zhǔn)確。

5.單染對(duì)照的染色結(jié)果必須與實(shí)驗(yàn)樣本亮度相同或更高,以模擬實(shí)驗(yàn)中的任何熒光溢漏情況。

6.對(duì)于任何對(duì)照,陰性和陽性群體的自發(fā)熒光必須相同。做法是單獨(dú)為每個(gè)通道的陽性和陰性群設(shè)門,避免使用通用的陰性對(duì)照。

7.單染對(duì)照的染色結(jié)果,必須要陰陽分群明顯。全陰性,全陽性或者陰陽分群不明顯的樣本都不可作為單染對(duì)照。

8.補(bǔ)償依賴于熒光強(qiáng)度中位值的準(zhǔn)確計(jì)算,軟件能對(duì)熒光的溢出進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性確定,如果事件太少,將無法準(zhǔn)確計(jì)算,因此事件收集數(shù)量應(yīng)多于5000個(gè)。

9.單染對(duì)照和實(shí)驗(yàn)樣本的處理要相同,上機(jī)電壓也要保持一致。

10.一些低表達(dá)靶標(biāo)(例如IL-17A、IFN-γ等)的陽性細(xì)胞群非常少,調(diào)節(jié)補(bǔ)償時(shí),軟件不能正確識(shí)別甚至識(shí)別不出,此時(shí)可以選擇該樣本高表達(dá)的一些靶標(biāo)(例如CD3、CD4等),用相同的熒光標(biāo)記來代替低表達(dá)靶標(biāo)。

11.補(bǔ)償值一般不會(huì)超過100%,如果出現(xiàn)超過100%的情況,可能是串聯(lián)染料斷裂導(dǎo)致。另外,補(bǔ)償值不會(huì)出現(xiàn)負(fù)值,如果出現(xiàn),則表示某些通道存在過補(bǔ)償。

12.軟件自動(dòng)調(diào)節(jié)完補(bǔ)償,可以打開補(bǔ)償面板,觀察一下每個(gè)通道的補(bǔ)償是否合理。若不合理,可以適當(dāng)進(jìn)行微調(diào)。

13.為了更合理地圈出陰陽群,我們可以先根據(jù)FSC和SSC,圈出對(duì)應(yīng)細(xì)胞群,這樣更有利于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。



抗體捕獲微球與抗體重鏈結(jié)合,因此與生物樣本不同,不需要特異性抗原識(shí)別。作為實(shí)用性補(bǔ)償試劑,這些微球可提高補(bǔ)償?shù)囊恢滦?,特別適用于:

1.陽性群體染色暗淡或稀少。補(bǔ)償微球具有強(qiáng)烈的熒光信號(hào),使得補(bǔ)償對(duì)照的亮度與實(shí)驗(yàn)樣本相同或更高。

2.需要處理多種熒光染料。

3.樣本數(shù)量有限。



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